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WB實驗組織總蛋白提取方法
WB組織總蛋白提取步驟
第一步提取組織蛋白上清液
1,準備裂解液
(1)溶PMSF(將PMSF晶體溶到PMSF溶劑中,即配成10ml100mM的PMSF液體)
(2)裂解液的制備
組成:PIRA裂解液+PMSF溶劑+蛋白酶抑制劑
10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制劑
(3)將配好的裂解液放在4℃?zhèn)溆谩?/p>
2,研磨組織(心尖)
(1)準備研缽,藥勺(2把),長鑷子,保溫箱(里面放入冰塊),湯勺,離心管,天平,手套(2幅),液氮,冰盤,振蕩器。
(2)將所有接觸到組織的工具用液氮預(yù)冷。
(3)1人負責將組織組織給研磨者并隨時加液氮(此人必須記住每次研磨者所研磨的組織的編號)2人研磨組織(多次快速),同時一人將1.5ml離心管編號預(yù)冷去皮。
(4)將研磨好的組織放在去皮處理的對應(yīng)的離心管中稱重。(用大白紙記錄好每個樣的重量,便于離心時配平用)。
(5)加裂解液(1mg組織加6ul裂解液)。
(6)震蕩混勻后放入冰盤上,等所有的樣加完后一齊在搖床上搖1h。
3,離心提取蛋白上清液
(1)提前30min預(yù)冷離心機(4℃)。
(2)配平。
(3)離心,按照配平時的組放樣(13000r,5min)。
(4)取上清液,儲存在-20℃?zhèn)溆谩#ㄌ崆皩?.5ml的離心管編號)。
第二步BCA法測蛋白濃度
1,37℃預(yù)熱水浴箱
2,配蛋白標準液
(1)準備9個1.5ml離心管并編號A,B,C,D,E,F,G,H,I
(2)按照說明書配制標準樣。
3,將蛋白上清液稀釋十倍
(1)準備0.5ml的離心管并編號。
(2)取上清液6ul,然后加入54ul蒸餾水,震蕩混勻。
2,配BCA工作液
RagentA:B=50:1
工作液所需用量計算:
總體積=(n待測樣+9標準樣)×2×200ul
其中A液xx,B液xx。
3,向酶標板(96孔板)中加入蛋白和工作液
先加25ul蛋白,再加200ul工作液,每個樣加兩個孔。
1234596孔板視圖6789101112
4,加完工作液后搖床搖30min,放入37℃水浴30min。(最好蓋上蓋)5,預(yù)熱酶標儀37℃
6,酶標儀使用方法
(1)打開MPM6軟件
(2)File-New
(3)文件-Intrument-Setup-Single-波長562nm-OK
(4)File-Readnewplate
(5)ExpertDate:Max
7,根據(jù)OD值的平均數(shù)用EXCEL計算濃度(記得x10)。
第三步制備上樣蛋白
1,計算500ul上樣蛋白組成
蛋白上清液+1x樣緩(固定5x樣緩100ul)+超純水(可用蒸餾水代替)
(1)計算500ul上樣量所需的蛋白體積
V蛋白=2ug/ul×500ul/實際蛋白濃度(ug/ul)(注意:2ug/ul可以根據(jù)實際情況調(diào)整的)
(2)計算所需超純水體積
V水=500-100-V蛋白
(3)數(shù)據(jù)用excel計算并提前打印。
2,準備1.5ml的離心管編號。
3,將提前將5x樣緩取出解凍。
4,按照excel表中數(shù)據(jù)在離心管中加入蛋白上清液,樣緩以及超純水。5,震蕩混勻。
6,100℃水浴15min。
7,分裝備用。
作者:尹懿
北京體育大學(xué)運動人體科學(xué)學(xué)院2012級本科
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