動物固體組織蛋白提取-Protocol

時間：2021-11-05 19:40:41 資料我要投稿

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動物固體組織蛋白提取-Protocol

動物固體組織蛋白提取 Protocol

1、前夜將磁珠及勻漿管洗凈置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和勻漿管，自然晾干；也

可放入烤箱中，速度較快。

2、裂解液配制：RIPA：PMSF=100：1，現(xiàn)配現(xiàn)用。（1000ulRIPA+10ulPMSF）。置入4℃冰

上。

3、抽蛋白（應冰上進行）：

a、適量組織（最好放入液氮中反復研磨成粉狀）加入裂解液中。一般10ml管體系中加入：7-8粒磁珠、100mg組織、1mlRIPA+10ulPMSF、1 tablet Cocktail。 b、勻漿。

手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。

機器勻漿：用組織搗碎機10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

超聲粉碎：用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。

反復凍融：培養(yǎng)或者分離的細胞可以用以上的方法勻漿，也可以反復凍溶3次左右（即讓細胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結冰，溶解，再結冰，再溶解，反復3次左右），但有部分酶活力會受影響。 c、將組織勻漿轉入1.5ml的EP管中（eppendorf 管、離心管）。12000r/min 4°C 離心15min。 d、離心后EP管中液體分三層，提取中間無色液相，移入新的EP管中。可-80℃保存。 4、蛋白濃度測定。

a、配工作液：溶液A：溶液B=50：1（200ul：4ul）。

需測試復孔。標本X，則需A量=2*（

X+1+1）*200；B=2*（X+1+1）*4。

c、復孔，取蛋白6ul加入0.6mlEP管，再加入54ulH2O，混勻。即10倍稀釋。

d、取20-25ul 10倍稀釋蛋白樣本加入96孔板平底板內(nèi)，再加入200ulAB工作液，混勻振蕩后，37℃ incubate 30min。

注：應現(xiàn)加蛋白樣本，再加工作液。因為每次加蛋白后需換tip，再加入工作液即起反應，應縮短時間。

e、酶標儀檢測562nm吸光度。Program f、計算蛋白濃度。

根據(jù)標準曲線，如 Y=1.2745X-0.1684 其中Y：蛋白濃度；X：吸光度。最終蛋白濃度為：10*Y（ug/ul、mg/ml） g、蛋白樣本放-80℃凍存。

大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測定法定量。在典型的蛋白測定中，化學試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計或酶標儀檢測，并與已知濃度的蛋白標

準曲線作比較。博士德為大家提供兩種蛋白測定手段，每種都有其獨特的優(yōu)點。如果樣品數(shù)量較多，可以同時使用兩種測定用酶標儀自動檢測。當你選擇一種蛋白測定方法時需要考慮兩個因素：緩沖液的化學組成和檢測的蛋白量。

Commassie法（Bradford法）：原理：在酸性條件，蛋白質(zhì)與考馬斯染料G-250結合，顏色從棕色變?yōu)樗{色，在595nm處檢測吸光值然后與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。

BCA法：

原理：在堿性條件下，蛋白將Cu++還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色絡合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。

現(xiàn)對這兩種方法進行比較：一、實驗材料：

細胞總蛋白提取試劑盒（AR0103） M231

BCA蛋白定量試劑盒（AR0146）

Commassie改良增強型蛋白質(zhì)定量試劑盒（AR0145）二、操作步驟： Commassie法： 1.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

2.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

3.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應標記的微孔板中。 4.滴加200ul考馬斯增強型試劑（溶液A）至每孔混勻并充分震蕩30S 5.停止震蕩，在室溫孵育樣品10min 6.在酶標儀中測量595nm時的吸光值。

7.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。 BCA法：

1.按50體積BCA試劑A加入1倍體積BCA試劑B配置適量BCA工作液，充分混勻。 2.將BSA凍干標準品（10mg/支）用生理鹽水或PBS稀釋成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八個濃度的蛋白標準溶液。

3.M231用細胞總蛋白提取試劑提取總蛋白。

4.各取20ul蛋白標準品和待測M231樣品至相應標記的微孔板中。 5.滴加200ulBCA工作液至每孔混勻并充分震蕩30S 6.停止震蕩，在37度孵育樣品30min 7.在酶標儀中測量562nm時的吸光值。

8.繪制標準曲線，再用標準曲線判斷出樣品的蛋白濃度。三、實驗結果

其中1到8為2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的標準濃度的BSA蛋白，9為空白孔，樣品1為8倍稀釋M231總蛋白，樣品2為32倍稀釋M231總蛋白

Commassie法：

為了測試準確，應在試劑加入后的5～20min內(nèi)測定光吸收，因為在這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.4mg/ml

Commassie法優(yōu)點是：

1.靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1ug。這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。

2.測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。

此法的缺點是：

1.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用g—球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的`偏差。

2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干擾Lowary法一樣）。

3. 標準曲線也有輕微的非線性，在0-1000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好線性。因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。

BCA法：

由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml BCA法特點： 1. 靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。 2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關系。 4. 檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。 5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有優(yōu)勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。

（Radio Immunoprecipitation Assay）RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。 RIPA使用方法

對于培養(yǎng)細胞樣品：

1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

2. 對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。對于組織樣品：

1. 把組織剪切成細小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。)

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正�，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組

DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子，例如NFκB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。各種RIPA的差別及用途

蛋白酶及蛋白酶抑制劑大全摘要：

破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了5種常

用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。

蛋白酶抑制劑

破碎細胞提取蛋白質(zhì)的同時可釋放出蛋白酶，這些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白質(zhì)不被降解。在蛋白質(zhì)提取過程中，需要加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解。以下列舉了5種常用的蛋白酶抑制劑和他們各自的作用特點，因為各種蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的敏感性各不相同，因此需要調(diào)整各種蛋白酶的濃度。由于蛋白酶抑制劑在液體中的溶解度極低，尤其應注意在緩沖液中加人蛋白酶抑制劑時應充分混勻以減少蛋白酶抑制劑的沉淀。在寶靈曼公司的目錄上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制劑表。

常用抑制劑

PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride（劇毒）

1)抑制絲氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巰基蛋白酶(如木瓜蛋白酶);

2)10mg/ml溶于異丙醇中;

3)在室溫下可保存一年; 2-8℃可以存放數(shù)月之久。欲長期保存，可凍存在-20℃ 4)工作濃度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 儲存液濃度為100或200mM

5)在水液體溶液中不穩(wěn)定，必須在每一分離和純化步驟中加入新鮮的PMSF。 EDTA

1)抑制金屬蛋白水解酶;

2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃穩(wěn)定六個月以上;

4)工作濃度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml);

5)加入NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值，否則EDTA不溶解。胃蛋白酶抑制劑(pepstantin)

l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管緊張肽原酶，組織蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中;

3}儲存液在4℃一周內(nèi)穩(wěn)定，-20℃穩(wěn)定6個月; 4)1作濃度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。