人血紅素加氧酶-1的原核表達(dá)、純化及其中和抗體的制備

目的 確定人血紅素加氧酶-1(human heme oxygenase-1,hHO-1)在大腸埃希菌中的表達(dá)條件與純化方法,利用純化的蛋白制備具有中和活性的hHO-1多克隆抗體.方法 將hHO-1原核表達(dá)質(zhì)粒pMW172/hHO-1轉(zhuǎn)入大腸埃希菌菌株BL21,通過(guò)改變搖床轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)劑IPTG濃度和培養(yǎng)時(shí)間確定hHO-1蛋白的最佳可溶性表達(dá)條件;利用超聲破碎、高速離心、分級(jí)鹽析、分子篩層析等方法純化hHO-1蛋白,建立體外HO-1活性測(cè)定方法檢測(cè)hHO-1蛋白的活性;利用純化的hHO-1活性蛋白作為抗原免疫新西蘭兔,制備多克隆抗體;利用ELISA方法和Western印跡技術(shù)分別測(cè)定抗體的效價(jià)和特異性,通過(guò)HO-1活性測(cè)定檢測(cè)抗體的中和活性.結(jié)果 確定hHO-1最佳可溶性表達(dá)條件為:37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 h后,0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h.超聲破碎菌體,上清經(jīng)30%～40%鹽析純化及分子篩層析純化,獲得活性hHO-1蛋白,收得率為30.3%,純化倍數(shù)為2.83倍,純度為90 %.制備的抗hHO-1的兔血清效價(jià)達(dá)到10~6,并能中和掉46 % hHO-1的催化活性.結(jié)論 為hHO-1蛋白的表達(dá)和純化以及多克隆抗體制備確立了可行的技術(shù)方案;獲得了高純度活性hHO-1蛋白及hHO-1多克隆抗體,為HO-1功能、結(jié)構(gòu)研究,以及相關(guān)疾病研究奠定了基礎(chǔ).

作 者： 魏旭冉 楊軍 劉慶軍 王波 周虹 WEI Xuran YANG Jun LIU Qingjun WANG Bo ZHOU Hong   作者單位： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所,北京市,100850  刊 名： 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志  ISTIC 英文刊名： JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY  年，卷(期)： 2010 7(2)  分類號(hào)： Q55  關(guān)鍵詞： 血紅素加氧酶   原核表達(dá)   可溶性表達(dá)   純化   中和抗體   heme oxygenase-1   prokaryotic expression   soluble expression   purification   neutralization antibody  

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