不同產(chǎn)地蓮子心及化學(xué)成分研究論文
摘要：：目的：評價(jià)并比較不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物及其部分化學(xué)成分的抗氧化能力。方法：采用DPPH法和ORAC法，評價(jià)了9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心以及其中分離得到的9個(gè)化學(xué)成分的抗氧化能力。結(jié)果：湖南湘潭產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物對DPPH自由基清除的IC50值為101．65μg/mL，對氧自由基吸收能力的ORAC值為3．41（μmolTE/μg），在兩種體外抗氧化測試模型中均表現(xiàn)出最好的抗氧化效果。蓮子心分離得到的化學(xué)成分中黃酮類化合物對DPPH自由基清除能力強(qiáng)于生物堿類化合物，但是這兩類化合物對ORAC氧自由基吸收能力并無顯著性差異。結(jié)論：不同產(chǎn)地蓮子心及其部分化學(xué)成分抗氧化能力在不同的評價(jià)體系中有一定的差異性，蓮子心作為抗氧化劑具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。
關(guān)鍵詞：：蓮子心；抗氧化；DPPH；ORAC；生物堿；黃酮
蓮子心（Plumulanelumbinis），又名蓮薏、苦薏、蓮心，為睡蓮科蓮屬植物蓮（NelumbonuciferaGaertn．）的成熟種子的干燥幼葉及胚根，其性味苦寒，具有清心安神，交通心腎，澀精止血的功效，主要產(chǎn)地分布在我國湖南、湖北、福建、江蘇、浙江、江西、四川、山東等省［1］。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心中活性成分主要包括生物堿類化合物，如：蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿、去甲基烏藥堿、荷葉堿、前荷葉堿等［2－6］；以及黃酮類化合物，如：蘆丁、槲皮素、山奈酚、金絲桃苷、水仙苷等［7－11］。研究表明蓮子心中生物堿類化合物具有抗心律失常、降壓、降血糖、抗癌、抗病毒等藥理活性［12－15］，而其中的黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用［16－18］。
在抗氧化研究方面，陳靜［19］，鄭鐵松等［20］報(bào)道了蓮子心的水提取液和乙醇提取液對Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基和鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的超氧陰離子均有清除作用；張俊生等［21］報(bào)道了蓮子心乙醇提取物具有清除羥基自由基及抗油脂氧化作用；楊小青等［22］報(bào)道了蓮子心總生物堿對DPPH、ABTS+、羥基自由基和超氧陰離子具有很強(qiáng)的清除活性；陳銘等［23］報(bào)道了超微粉碎能明顯提高蓮子心的還原能力、DPPH和ABTS+自由基清除能力、總氧自由基吸收能力以及細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。但是，尚未見文獻(xiàn)有使4962用ORAC氧自由基吸收能力法對蓮子心提取物進(jìn)行體外抗氧化評價(jià)的報(bào)道，也未有文獻(xiàn)對不同產(chǎn)地來源的蓮子心的體外抗氧化的差異進(jìn)行比較和評價(jià)。
近年來，隨著自由基生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究證明人體衰老、病變和慢性疾病的發(fā)病過程均和自由基以及活性氧有關(guān)。DPPH法最早由Blois報(bào)道，后經(jīng)一系列修訂，已在全世界范圍內(nèi)被廣泛用于自由基清除能力的定量分析［24］。其原理為：1，1－二苯基－2－苦味酰基苯肼（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH）是一種穩(wěn)定的自由基，其甲醇或乙醇溶液呈紫紅色，在波長為517nm下有最大吸收峰。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉，溶液顏色由紫紅色變?yōu)辄S色，在最大吸收波長517nm處的吸光度變小。因此，可由吸光度的降低表示自由基清除率，清除率越大，樣品抗氧化能力越強(qiáng)［25］。
而被譯為抗氧化能力指數(shù)的oxygenradicalabsorbancecapacity（ORAC）方法，是目前抗氧化研究領(lǐng)域中為人們所關(guān)注的一個(gè)評價(jià)方法。其原理為：FL（disodiumfluorescein）作為熒光底物，在波長485nm激發(fā)下，可在波長527nm下發(fā)射熒光。以偶氮類化合物AAPH［2，2’－azobis（2－amidinopro—pane）dihydrochloride］熱分解產(chǎn)生的過氧自由基（ROO）可將FL氧化，使其熒光特性消失。當(dāng)抗氧化劑存在時(shí)，F(xiàn)L與其競爭氧化劑，從而抑制其熒光消退的速率。ORAC（ox—ygenradicalabsorbancecapacity）法以一種維生素E水溶性類似物Trolox（6－h(huán)ydroxyl－2，5，7，8－tetramethylchroman－2－carboxylicacid）為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用熒光微孔板分析儀進(jìn)行分析［26－27］。本課題組前期建立了蓮子心藥材80%乙醇提取物的指紋圖譜，對9批不同產(chǎn)地的蓮子心藥材進(jìn)行了相似度評價(jià)以及其中生物堿含量的測定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地蓮子心樣品無論在指紋圖譜相似性以及生物堿含量方面均存在較大差異。為進(jìn)一步考察不同產(chǎn)地來源的蓮子心樣品的體外抗氧化活性之間的差異，本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，采用DPPH法和ORAC法，評價(jià)了9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心樣品的抗氧化活性。同時(shí)，本課題組對蓮子心的化學(xué)成分進(jìn)行了初步的分離，得到了9個(gè)單體化合物，本實(shí)驗(yàn)采用DPPH法和ORAC法，評價(jià)了這9個(gè)蓮子心主要化學(xué)成分的抗氧化能力，分析了生物堿和黃酮等不同種類的化學(xué)成分對蓮子心藥材總抗氧化能力的貢獻(xiàn)，為蓮子心的`進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。
1材料與儀器
1．1材料與試劑
1．1．1材料9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心購自不同的藥材公司，具體產(chǎn)地來源如下：湖南湘潭、福建建寧、福建福州、安徽亳州、湖北洪湖、江西廣昌、江西石城、山東微湖和四川成都，并經(jīng)暨南大學(xué)張英副教授鑒定為蓮子心（Plumulanelumbi—nis）。9個(gè)蓮子心單體化合物由本課題組提取分離所得，并鑒定為：蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿、槲皮素、異槲皮苷、山奈酚、金絲桃苷、蘆丁、水仙苷。1。1．2主要試劑1，1－二苯基－2－苦基肼（DPPH）、2，2’－偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）、熒光素鈉（FL）、VC、水溶性維生素E類似物（Trolox）均購于美國Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和無水乙醇均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；二甲基亞砜（DMSO，分子生物學(xué)專用）購于阿拉丁試劑公司；蒸餾水購于怡寶公司，以上試劑均為分析純。
1．2主要儀器與設(shè)備
TECANInfinite200多功能酶標(biāo)儀（奧地利公司）；PHS－3B雷磁PH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；ML－104電子天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）；移液槍（德國普蘭德（Brand）公司）；GrenerBio－One96孔黑、白酶標(biāo)板（德國葛萊娜第一生化股份有限公司）。
2方法
2．1蓮子心的提取
分別稱取9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心藥材100g，用12倍量80%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇浸泡過夜，回流提取3次，每次2h，合并提取液濃縮至無醇味，冷凍干燥即得各產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物，備用。
2．2DPPH自由基清除能力測定方法
用DMSO溶解樣品，并稀釋成系列濃度。測定時(shí)采用96孔酶標(biāo)板，設(shè)空白組（2×10－4MDPPH100μL+DMSO100μL）、樣品組（2×10－4MDPPH100μL+待測樣品100μL），陽性對照組（2×10－4MDPPH100μL+VC100μL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。震蕩混勻后，室溫避光放置30min，于波長517nm處測吸光度OD值。按如下公式計(jì)算待測樣品的自由基清除率：自由基清除率=（OD空白－OD樣品）/OD空白×100%。
2．3氧自由基吸收能力（ORAC）測定方法
測定使用96孔黑色酶標(biāo)板，于避光環(huán)境中加樣。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，對于不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物確定樣品的初始濃度為6．25μg/mL，Trolox標(biāo)準(zhǔn)對照品和VC陽性對照的初始濃度為6．25μM，對于蓮子心部分單體化合物確定樣品、VC陽性對照和Trolox標(biāo)準(zhǔn)對照品的初始濃度均為6．25μM。依次每孔加入待測樣品溶液20μL、PBS緩沖溶液20μL、熒光素鈉溶液（FL）20μL。放入酶標(biāo)儀中，37℃下震蕩30s，孵育10min。接著，除了陰性對照組不加AAPH外，其余各空均加入140μL153mMAAPH溶液后，立即放入微孔板讀數(shù)儀中，每2min記錄1次熒光數(shù)值，記錄120min。其中，陽性對照組加VC溶液，標(biāo)準(zhǔn)對照組加Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液。計(jì)算結(jié)果以抗氧化能力指數(shù)［27］（即抗氧化劑的氧自由基清除能力ORAC值）表示。
3結(jié)果與分析
3．1不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物的體外抗氧化能力比較
3．1．1DPPH自由基清除能力測定9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心DPPH自由基清除率的IC50值見表1。以VC（IC50為4．96μg/mL）作為陽性對照組，比較發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物DPPH自由基清除能力依次為：湖南湘潭＞江西廣昌＞福建福州＞福建建寧＞四川成都＞湖北洪湖＞江西石城＞安徽亳州＞山東微湖。
其中，湖南湘潭產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物DPPH自由基清除能力最強(qiáng)。3．1．2氧自由基吸收能力（ORAC）測定9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心氧自由基吸收能力ORAC值見表2。以VC（ORAC值為3．40μmolTE/μmol）作為陽性對照組，比較發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物ORAC值依次為：湖南湘潭＞江西廣昌＞福建建寧＞湖北洪湖＞江西石城＞山東微湖＞四川成都＞安徽亳州＞福建福州。其中，湖南湘潭產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物氧自由基吸收能力最強(qiáng)，ORAC值為3。41。以O(shè)ringinPro8．5統(tǒng)計(jì)軟件作圖，結(jié)果見插頁ⅩⅤ圖1。表1不同產(chǎn)地蓮子心DPPH自由基清除能力IC50值（n=3）
3．2蓮子心部分化學(xué)成分的體外抗氧化能力測試
3．2．1DPPH自由基清除能力測定蓮子心部分化學(xué)成分DPPH自由基清除率的IC50值見表3。以VC作為陽性對照，比較發(fā)現(xiàn)蓮子心部分單體化合物中黃酮類化合物DPPH自由基清除能力表現(xiàn)較好，生物堿類較差。3．2．2氧自由基吸收能力（ORAC）測定蓮子心部分部分化學(xué)成分氧自由基吸收能力ORAC值見表4。以VC作為陽性對照，比較發(fā)現(xiàn)蓮子心部分單體化合物ORAC值與陽性對照組相差無幾，生物堿類和黃酮類化合物表現(xiàn)出無明顯差異。其中，金絲桃苷氧自由基吸收能力最強(qiáng)，ORAC值為4．02。以O(shè)ringinPro8．5統(tǒng)計(jì)軟件作圖，結(jié)果見插頁ⅩⅤ圖2。
4結(jié)論
4．1不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物體外抗氧化能力綜合評價(jià)
通過DPPH自由基清除法和氧自由基吸收能力（ORAC）法測定9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物抗氧化能力，綜合評價(jià)發(fā)現(xiàn)：湖南湘潭產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物在兩種評價(jià)體系中均顯示出最強(qiáng)的抗氧化能力，另外江西廣昌和福建建寧產(chǎn)地的蓮子心乙醇提取物也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。
4．2蓮子心單體化合物體外抗氧化能力綜合評價(jià)
通過DPPH自由基清除法和氧自由基吸收能力（ORAC）法測定9個(gè)蓮子心單體化合物，發(fā)現(xiàn)在不同的評價(jià)體系中同種單體化合物抗氧化能力表現(xiàn)有差異性，總體表現(xiàn)為對DPPH自由基清除能力黃酮類化合物較好，對氧自由基吸收能力生物堿類和黃酮類化合物無明顯差異，也進(jìn)一步證實(shí)了不同種類單體化合物的抗氧化機(jī)理有所不同，從而對總抗氧化能力有不同的貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)對9個(gè)不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物抗氧化作用的研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地蓮子心乙醇提取物體外抗氧化能力差異較大，因此在今后的研究中以該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為指導(dǎo)，選擇合適產(chǎn)地的蓮子心藥材。
同時(shí)，發(fā)現(xiàn)蓮子心中生物堿類和黃酮類化合物的抗氧化活性在不同的評價(jià)體系中也表現(xiàn)有差異，不同產(chǎn)地蓮子心生物堿類和黃酮類化合物含量不同可能導(dǎo)致了其乙醇提取物體外抗氧化能力的差異。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探索蓮子心化學(xué)成分與其藥理活性之間的關(guān)系、在預(yù)防和治療自由基誘發(fā)的疾病及延緩衰老等方面提供科學(xué)依據(jù)。
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