微生物實(shí)驗(yàn)工作總結(jié)
一、培養(yǎng)基
�。ㄒ唬┡囵B(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分
一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，有些微生物需要添加特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需添加生長(zhǎng)因子：維生素）
高考警示鐘：自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同
(1)自養(yǎng)微生物所需的碳源來(lái)自含碳的無(wú)機(jī)物（如CO2），而異養(yǎng)微生物需要的碳源來(lái)自含碳的有機(jī)物，因此可根據(jù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類型。
(2)含氮無(wú)機(jī)物不但能給自養(yǎng)微生物提供氮源，也能作為能源物質(zhì)，提供能量，如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源也作為能源。
（二）培養(yǎng)基的配制原則
(1)目的明確。要根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等選擇原料、配制培養(yǎng)基。
(2)營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)。各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要保證適當(dāng)?shù)臐舛群捅壤�。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例過(guò)低，不能滿足微生物生長(zhǎng)；濃度過(guò)高則會(huì)抑制微生物的正常生長(zhǎng)。
(3)pH要適當(dāng)。不同微生物生長(zhǎng)所需pH不同。如細(xì)菌為中性或微堿性（6.5～7.5）；霉菌等真菌為酸性（5.0～6.0）。
�。ㄈ┡囵B(yǎng)基的分類及作用：
1.物理性質(zhì)：根據(jù)是否添加瓊脂等凝固劑
�。�1）液體培養(yǎng)基：不加凝固劑，常用于工業(yè)生產(chǎn)
（2）固體培養(yǎng)基：加凝固劑，常用于微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)
2.用途或功能
�。�1）選擇培養(yǎng)基：培養(yǎng)基中加入或去除某種化學(xué)物質(zhì)，允許特定種類的微生物生長(zhǎng),同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)。
常見例子：
�、倥囵B(yǎng)基中加入青霉素，篩選酵母茵或霉菌等真菌；
�、谂囵B(yǎng)基中加入高濃度食鹽，篩選金黃色葡萄球菌；
�、蹮o(wú)氮培養(yǎng)基，篩選固氮微生物；
�、軣o(wú)碳培養(yǎng)基，篩選自養(yǎng)微生物；
�、菀允蜑槲ㄒ惶荚�，選擇能分解石油的微生物；
�、抟阅蛩貫槲ㄒ坏�，篩選尿素分解菌；
�、咭岳w維素為唯一碳源，通過(guò)是否產(chǎn)生透明圈篩選纖維素分解菌。
�、鄬⑴囵B(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，分離耐高溫的微生物。
�。�2）鑒別培養(yǎng)基：根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,以鑒別不種類的微生物。
�、僖良t一美藍(lán)培養(yǎng)基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有，茵落呈深紫色，并帶有金屬光澤)；
�、谂囵B(yǎng)基中加入酚紅指示劑，鑒定尿素分解菌；
�、叟囵B(yǎng)基中加入剛果紅（CR），鑒定纖維素分解菌。
注意：
①病毒為非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物體，專營(yíng)活細(xì)胞寄生，目前不能利用人工培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，需接種在動(dòng)植物組織中才能增殖。常用于培養(yǎng)病毒的是活雞胚。
�、诩尤肱囵B(yǎng)基中的凝固劑(如瓊脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
二、無(wú)菌技術(shù)
（一）關(guān)鍵
獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌入侵。
�。ǘ┫�、滅菌:
二者主要區(qū)別中：芽孢和孢子是否存活（芽孢是微生物度過(guò)不良環(huán)境的體眠體，而孢子是微生物進(jìn)行無(wú)性生殖時(shí)的繁殖體即無(wú)性生殖細(xì)胞。）
1.消毒:使用較為溫和的物理或化學(xué)方法，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)
常用方法
應(yīng)用范圍
巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min
一些不耐高溫的物體如牛奶
煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min
一般物品
化學(xué)藥劑消毒法：用乙醇、氯氣、KMnO4等藥劑來(lái)殺死或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)或繁殖
可用來(lái)對(duì)環(huán)境、雙手和衣物等消毒
紫外線消毒法：30W紫外燈照射30min
接種室、接種箱、超凈工作臺(tái)
2.滅菌:使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用方法
應(yīng)用范圍
灼燒滅菌法：酒精燈火焰
接種工具如接種環(huán)、接種針等
干熱滅菌法：在160～170℃加熱1～2h
如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具
高壓蒸汽滅菌：壓力為100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min
培養(yǎng)基及容器的滅菌
注意：
�。�1）酒精消毒用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精效果最好，濃度過(guò)低。殺菌力弱，濃度過(guò)高，會(huì)使菌體表面蛋白凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能進(jìn)入其中
�。�2）關(guān)于高壓蒸汽滅菌注意以下幾點(diǎn)：
�、賶毫�100 kPa，溫度為12l℃的條件下，維持15～30 min；
②注意同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，使螺栓松緊一致；
③到滅菌時(shí)間后，當(dāng)壓力表的壓力降為零時(shí)，才能打開排氣閥，否則滅菌鍋的液體會(huì)沖出容器，造成污染。
�。�3）滅菌消毒的原理，就是通過(guò)一定理化手段，使病原茵蛋白質(zhì)變性，失去生命活性。
�。�4）灼燒滅菌用的是酒精燈火焰的充分燃燒層。
三、微生物的純化培養(yǎng)技術(shù)
�。ㄒ唬┏Ｓ眉�(xì)菌培養(yǎng)基——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制流程：
計(jì)算
稱量
溶化
滅菌
注意：據(jù)配方計(jì)算配制一定體積培養(yǎng)基時(shí)各成分的用量
注意：
�、俚蛊桨鍟r(shí)，燒杯口要通過(guò)酒精燈火焰滅菌。
�、谄桨謇淠笠獙⑵桨宓怪茫瓤煞乐姑笊w上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基造成污染；又可使培養(yǎng)基表面的水分更好的揮發(fā)。
�。ㄕ{(diào)PH）
倒平板
注意：
�、倥Ｈ飧噍^粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量
�、谂Ｈ飧嗟鞍纂艘孜�，動(dòng)作要迅速
注意：
①溶化瓊脂時(shí)要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂；
②加熱過(guò)程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度
注意：
由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié)pH
注意：
�、儆酶邏赫羝麥缇�
�、谂囵B(yǎng)基先調(diào)PH再滅菌
�、垡话闶桥囵B(yǎng)基先滅菌再倒平板
計(jì)算
稱量
溶化
滅菌
注意：據(jù)配方計(jì)算配制一定體積培養(yǎng)基時(shí)各成分的用量
注意：
�、俚蛊桨鍟r(shí)，燒杯口要通過(guò)酒精燈火焰滅菌。
②平板冷凝后要將平板倒置，既可防止皿蓋上凝結(jié)的水滴滴入培養(yǎng)基造成污染；又可使培養(yǎng)基表面的水分更好的'揮發(fā)。
�。ㄕ{(diào)PH）
倒平板
注意：
①牛肉膏較粘稠，應(yīng)玻棒挑取，在稱量紙上稱量
�、谂Ｈ飧嗟鞍纂艘孜�，動(dòng)作要迅速
注意：
�、偃芑傊瑫r(shí)要不斷攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂；
�、诩訜徇^(guò)程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度
注意：
由于不同微生物適宜的pH不同，因此在熔化后，必須用NaOH或HCl來(lái)調(diào)節(jié)pH
注意：
�、儆酶邏赫羝麥缇�
②培養(yǎng)基先調(diào)PH再滅菌
�、垡话闶桥囵B(yǎng)基先滅菌再倒平板
（二）純化大腸桿菌
1．原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個(gè)細(xì)胞，使其長(zhǎng)成單個(gè)的菌落，這個(gè)菌落就是純化的細(xì)菌菌落。
2．微生物接種方法：
平板劃線法（只可純化）和稀釋涂布平板法（既可純化又可計(jì)數(shù)）
(1)平板劃線法：固體培養(yǎng)上→連續(xù)劃線→逐步稀釋→單個(gè)細(xì)胞繁殖而成的菌落 (如圖)
注意：
a.用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線結(jié)束都要進(jìn)行灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；
燒灼時(shí)期
目的
取菌種前
殺死接種環(huán)上原有微生物
每次劃線前
殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留菌種，使下次劃線的菌種直接來(lái)自于上次劃線末端，使每次劃線菌種數(shù)目減少，達(dá)到分離菌株的目的
接種結(jié)束后
殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者
b.劃線時(shí)不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開始，首尾區(qū)不能相連；
c.操作必須始終在酒精燈火焰旁進(jìn)行。
(2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作(一系列梯度稀釋) →稀釋度足夠高的菌液→分散成單個(gè)細(xì)胞→單個(gè)菌落
稀釋涂布平板的操作比較復(fù)雜，且各個(gè)細(xì)節(jié)均需保證“無(wú)菌”，應(yīng)特別注意：
a.配制系列梯度稀釋液時(shí)，必須用無(wú)菌水配制；
b.涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過(guò)熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中，一面引燃其中的酒精；
c. 吸管頭不要接觸任何其他物體；吸管要在酒精燈火焰周圍使用。
3．菌種的保存
保存時(shí)間
保存方法
具體方法
后續(xù)處理
頻繁
使用
臨時(shí)保藏法
將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)，長(zhǎng)成菌落后，放入4_℃的冰箱中保藏
每3～6個(gè)月需重新接種。否則菌種容易被污染或產(chǎn)生變異
長(zhǎng)期
保存
甘油
管藏法
在3 mL甘油瓶中，裝入1 mL甘油后滅菌，將1 mL菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中與甘油充分混合
放入－20_℃的冷凍箱中保存
將菌種放在低溫環(huán)境中保藏的目的是降低微生物的新陳代謝速率。
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